പിസിആർ പ്രതിപ്രവർത്തനങ്ങളിലെ ഇടപെടൽ ഘടകങ്ങൾ

പിസിആർ പ്രതിപ്രവർത്തന സമയത്ത്, ചില തടസ്സപ്പെടുത്തുന്ന ഘടകങ്ങൾ പലപ്പോഴും നേരിടാറുണ്ട്.
PCR ന്റെ വളരെ ഉയർന്ന സംവേദനക്ഷമത കാരണം, PCR ഫലങ്ങളെ ബാധിക്കുന്ന ഏറ്റവും പ്രധാനപ്പെട്ട ഘടകങ്ങളിലൊന്നായി മലിനീകരണം കണക്കാക്കപ്പെടുന്നു, കൂടാതെ തെറ്റായ പോസിറ്റീവ് ഫലങ്ങൾ ഉണ്ടാക്കാനും സാധ്യതയുണ്ട്.
തെറ്റായ-നെഗറ്റീവ് ഫലങ്ങളിലേക്ക് നയിക്കുന്ന വിവിധ സ്രോതസ്സുകളും ഒരുപോലെ നിർണായകമാണ്. PCR മിശ്രിതത്തിന്റെ ഒന്നോ അതിലധികമോ അവശ്യ ഭാഗങ്ങളോ ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ പ്രതിപ്രവർത്തനമോ തടയപ്പെടുകയോ തടസ്സപ്പെടുകയോ ചെയ്താൽ, രോഗനിർണയ പരിശോധന തടസ്സപ്പെട്ടേക്കാം. ഇത് കാര്യക്ഷമത കുറയുന്നതിനും തെറ്റായ-നെഗറ്റീവ് ഫലങ്ങൾ പോലും ഉണ്ടാകുന്നതിനും കാരണമാകും.
സാമ്പിൾ തയ്യാറാക്കുന്നതിന് മുമ്പുള്ള ഷിപ്പിംഗ് അല്ലെങ്കിൽ/അല്ലെങ്കിൽ സംഭരണ ​​സാഹചര്യങ്ങൾ കാരണം ഇൻഹിബിഷനു പുറമേ, ടാർഗെറ്റ് ന്യൂക്ലിക് ആസിഡ് സമഗ്രത നഷ്ടപ്പെടാം. പ്രത്യേകിച്ച്, ഉയർന്ന താപനിലയോ സംഭരണത്തിന്റെ അപര്യാപ്തതയോ കോശങ്ങളുടെയും ന്യൂക്ലിക് ആസിഡുകളുടെയും നാശത്തിലേക്ക് നയിച്ചേക്കാം. കോശങ്ങളുടെയും ടിഷ്യു ഫിക്സേഷനും പാരഫിൻ എംബെഡിംഗും ഡിഎൻഎ വിഘടനത്തിനും സ്ഥിരമായ പ്രശ്നത്തിനും അറിയപ്പെടുന്ന കാരണങ്ങളാണ് (ചിത്രം 1 ഉം 2 ഉം കാണുക). ഇത്തരം സന്ദർഭങ്ങളിൽ, ഒപ്റ്റിമൽ ഐസൊലേഷനും ശുദ്ധീകരണവും പോലും സഹായിക്കില്ല.

ചിത്രം 1 | ഡിഎൻഎ സമഗ്രതയിൽ ഇമോബിലൈസേഷന്റെ പ്രഭാവം
പോസ്റ്റ്‌മോർട്ടത്തിലെ പാരഫിൻ വിഭാഗങ്ങളിൽ നിന്ന് വേർതിരിച്ചെടുത്ത ഡിഎൻഎയുടെ ഗുണനിലവാരം ഗണ്യമായി വ്യത്യാസപ്പെട്ടിരിക്കുന്നതായി അഗരോസ് ജെൽ ഇലക്ട്രോഫോറെസിസ് കാണിച്ചു. ഫിക്സേഷൻ രീതിയെ ആശ്രയിച്ച് വ്യത്യസ്ത ശരാശരി ശകല നീളമുള്ള ഡിഎൻഎ എക്സ്ട്രാക്റ്റുകളിൽ ഉണ്ടായിരുന്നു. നേറ്റീവ് ഫ്രീസുചെയ്ത സാമ്പിളുകളിലും ബഫർ ചെയ്ത ന്യൂട്രൽ ഫോർമാലിനും ഉറപ്പിച്ചപ്പോൾ മാത്രമേ ഡിഎൻഎ സംരക്ഷിക്കപ്പെട്ടിരുന്നുള്ളൂ. ശക്തമായ അസിഡിറ്റി ഉള്ള ബൗയിൻ ഫിക്സേറ്റീവ് അല്ലെങ്കിൽ അൺബഫർ ചെയ്ത, ഫോർമിക് ആസിഡ് അടങ്ങിയ ഫോർമാലിൻ ഉപയോഗിച്ചതിന്റെ ഫലമായി ഡിഎൻഎയുടെ ഗണ്യമായ നഷ്ടം സംഭവിച്ചു. ശേഷിക്കുന്ന ഭാഗം വളരെ വിഘടിച്ചിരിക്കുന്നു.
ഇടതുവശത്ത്, ശകലങ്ങളുടെ നീളം കിലോബേസ് ജോഡികളിൽ (kbp) പ്രകടിപ്പിക്കുന്നു.

ചിത്രം 2 | ന്യൂക്ലിക് ആസിഡ് ലക്ഷ്യങ്ങളുടെ സമഗ്രത നഷ്ടപ്പെടുന്നു
(എ) രണ്ട് സ്ട്രോണ്ടുകളിലും 3′-5′ വിടവ് ഉണ്ടാകുന്നത് ലക്ഷ്യ ഡിഎൻഎയിൽ ഒരു ഇടവേളയ്ക്ക് കാരണമാകും. ചെറിയ ഭാഗത്താണ് ഡിഎൻഎയുടെ സിന്തസിസ് ഇപ്പോഴും സംഭവിക്കുന്നത്. എന്നിരുന്നാലും, ഡിഎൻഎ ഭാഗത്തിൽ ഒരു പ്രൈമർ അനീലിംഗ് സൈറ്റ് ഇല്ലെങ്കിൽ, ലീനിയർ ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ മാത്രമേ സംഭവിക്കൂ. ഏറ്റവും അനുകൂലമായ സാഹചര്യത്തിൽ, ഭാഗങ്ങൾ പരസ്പരം വീണ്ടും പൂരിതമാക്കിയേക്കാം, പക്ഷേ വിളവ് ചെറുതും കണ്ടെത്തൽ നിലവാരത്തിന് താഴെയുമായിരിക്കും.
(b) പ്രധാനമായും ഡീപ്യൂരിനേഷനും തൈമിഡിൻ ഡൈമർ രൂപീകരണവും മൂലം ബേസുകൾ നഷ്ടപ്പെടുന്നത്, H-ബോണ്ടുകളുടെ എണ്ണത്തിൽ കുറവിനും Tm കുറയുന്നതിനും കാരണമാകുന്നു. നീണ്ടുനിൽക്കുന്ന ചൂടാക്കൽ ഘട്ടത്തിൽ, പ്രൈമറുകൾ മാട്രിക്സ് ഡിഎൻഎയിൽ നിന്ന് ഉരുകുകയും കുറഞ്ഞ കർശനമായ സാഹചര്യങ്ങളിൽ പോലും അനീൽ ചെയ്യുകയുമില്ല.
(സി) തൊട്ടടുത്തുള്ള തൈമിൻ ബേസുകൾ ഒരു ടിടി ഡൈമർ ഉണ്ടാക്കുന്നു.
ഫിനോൾ-ക്ലോറോഫോം വേർതിരിച്ചെടുക്കലുമായി താരതമ്യപ്പെടുത്തുമ്പോൾ ടാർഗെറ്റ് ന്യൂക്ലിക് ആസിഡുകളുടെ പ്രകാശനം ഒപ്റ്റിമലിൽ കുറവാണെന്നതാണ് മോളിക്യുലാർ ഡയഗ്നോസ്റ്റിക്സിൽ പലപ്പോഴും സംഭവിക്കുന്ന മറ്റൊരു സാധാരണ പ്രശ്നം. അങ്ങേയറ്റത്തെ സന്ദർഭങ്ങളിൽ, ഇത് തെറ്റായ നെഗറ്റീവുകളുമായി ബന്ധപ്പെട്ടിരിക്കാം. തിളപ്പിക്കുന്ന ലിസിസ് അല്ലെങ്കിൽ കോശ അവശിഷ്ടങ്ങളുടെ എൻസൈമാറ്റിക് ദഹനം വഴി ധാരാളം സമയം ലാഭിക്കാൻ കഴിയും, എന്നാൽ ഈ രീതി പലപ്പോഴും ന്യൂക്ലിക് ആസിഡ് റിലീസ് അപര്യാപ്തമായതിനാൽ കുറഞ്ഞ പിസിആർ സംവേദനക്ഷമതയ്ക്ക് കാരണമാകുന്നു.

ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ സമയത്ത് പോളിമറേസ് പ്രവർത്തനത്തെ തടയൽ

പൊതുവേ, സബ്‌ഒപ്റ്റിമൽ പിസിആർ ഫലങ്ങളിലേക്ക് നയിക്കുന്ന എല്ലാ ഘടകങ്ങളെയും വിവരിക്കുന്നതിന് ഒരു കണ്ടെയ്‌നർ ആശയമായി ഇൻഹിബിഷൻ ഉപയോഗിക്കുന്നു. കർശനമായി ബയോകെമിക്കൽ അർത്ഥത്തിൽ, ഇൻഹിബിഷൻ എൻസൈമിന്റെ പ്രവർത്തനത്തിൽ പരിമിതപ്പെടുത്തിയിരിക്കുന്നു, അതായത്, ഡിഎൻഎ പോളിമറേസിന്റെ സജീവ സൈറ്റുമായോ അതിന്റെ കോഫാക്ടറുമായോ (ഉദാ., ടാക് ഡിഎൻഎ പോളിമറേസിന് Mg2+) പ്രതിപ്രവർത്തനം വഴി സബ്‌സ്ട്രേറ്റ്-ഉൽപ്പന്ന പരിവർത്തനം കുറയ്ക്കുകയോ തടയുകയോ ചെയ്യുന്നു.
സാമ്പിളിലെ ഘടകങ്ങൾ അല്ലെങ്കിൽ റിയാജന്റുകൾ അടങ്ങിയ വിവിധ ബഫറുകൾ, എക്സ്ട്രാക്റ്റുകൾ എന്നിവ എൻസൈമിനെ നേരിട്ട് തടയുകയോ അതിന്റെ കോഫാക്ടറുകളെ (ഉദാ: EDTA) കുടുക്കുകയോ ചെയ്യും, അതുവഴി പോളിമറേസ് നിർജ്ജീവമാക്കുകയും അതുവഴി PCR ഫലങ്ങൾ കുറയുകയോ തെറ്റായി നെഗറ്റീവ് ആകുകയോ ചെയ്യും.
എന്നിരുന്നാലും, പ്രതിപ്രവർത്തന ഘടകങ്ങളും ലക്ഷ്യ-അടങ്ങിയ ന്യൂക്ലിക് ആസിഡുകളും തമ്മിലുള്ള പല ഇടപെടലുകളെയും 'PCR ഇൻഹിബിറ്ററുകൾ' എന്നും വിളിക്കുന്നു. ഒറ്റപ്പെടൽ വഴി കോശത്തിന്റെ സമഗ്രത തടസ്സപ്പെടുകയും ന്യൂക്ലിക് ആസിഡ് പുറത്തുവിടുകയും ചെയ്താൽ, സാമ്പിളും അതിന്റെ ചുറ്റുമുള്ള ലായനിയും സോളിഡ് ഫേസും തമ്മിലുള്ള ഇടപെടലുകൾ സംഭവിക്കാം. ഉദാഹരണത്തിന്, 'സ്കാവെഞ്ചറുകൾക്ക്' നോൺ-കോവാലന്റ് ഇടപെടലുകൾ വഴി സിംഗിൾ അല്ലെങ്കിൽ ഡബിൾ-സ്ട്രാൻഡഡ് ഡിഎൻഎയെ ബന്ധിപ്പിക്കാനും പിസിആർ പ്രതിപ്രവർത്തന പാത്രത്തിൽ ഒടുവിൽ എത്തുന്ന ലക്ഷ്യങ്ങളുടെ എണ്ണം കുറയ്ക്കുന്നതിലൂടെ ഐസൊലേഷനും ശുദ്ധീകരണവും തടസ്സപ്പെടുത്താനും കഴിയും.
പൊതുവേ, ക്ലിനിക്കൽ ഡയഗ്നോസ്റ്റിക് പരിശോധനകൾക്ക് ഉപയോഗിക്കുന്ന മിക്ക ശരീരദ്രവങ്ങളിലും റിയാജന്റുകളിലും (മൂത്രത്തിലെ യൂറിയ, രക്തത്തിലെ ഹീമോഗ്ലോബിൻ, ഹെപ്പാരിൻ), ഭക്ഷണ സപ്ലിമെന്റുകൾ (ജൈവ ഘടകങ്ങൾ, ഗ്ലൈക്കോജൻ, കൊഴുപ്പ്, Ca2+ അയോണുകൾ), പരിസ്ഥിതിയിലെ ഘടകങ്ങൾ (ഫിനോൾസ്, ഘന ലോഹങ്ങൾ) എന്നിവയിൽ PCR ഇൻഹിബിറ്ററുകൾ കാണപ്പെടുന്നു.

ബാക്ടീരിയ, യൂക്കാരിയോട്ടിക് കോശങ്ങൾ, ലക്ഷ്യമില്ലാത്ത ഡിഎൻഎ, ടിഷ്യു മാട്രിക്സുകളുടെ ഡിഎൻഎ-ബൈൻഡിംഗ് മാക്രോമോളിക്യൂളുകൾ, കയ്യുറകൾ, പ്ലാസ്റ്റിക്കുകൾ പോലുള്ള ലബോറട്ടറി ഉപകരണങ്ങൾ എന്നിവയിൽ കൂടുതൽ പ്രചാരത്തിലുള്ള പിസിആർ ഇൻഹിബിറ്ററുകൾ കണ്ടെത്താൻ കഴിയും. പിസിആർ ഇൻഹിബിറ്ററുകൾ വേർതിരിച്ചെടുക്കുന്ന സമയത്തോ അതിനുശേഷമോ ന്യൂക്ലിക് ആസിഡുകൾ ശുദ്ധീകരിക്കുന്നതാണ് നല്ലത്.
ഇന്ന്, വിവിധ ഓട്ടോമേറ്റഡ് എക്സ്ട്രാക്ഷൻ ഉപകരണങ്ങൾക്ക് നിരവധി മാനുവൽ പ്രോട്ടോക്കോളുകൾ മാറ്റിസ്ഥാപിക്കാൻ കഴിയും, എന്നാൽ ലക്ഷ്യങ്ങളുടെ 100% വീണ്ടെടുക്കലും/അല്ലെങ്കിൽ ശുദ്ധീകരണവും ഒരിക്കലും നേടിയിട്ടില്ല. ശുദ്ധീകരിച്ച ന്യൂക്ലിക് ആസിഡുകളിൽ സാധ്യതയുള്ള ഇൻഹിബിറ്ററുകൾ ഇപ്പോഴും ഉണ്ടായിരിക്കാം അല്ലെങ്കിൽ ഇതിനകം പ്രാബല്യത്തിൽ വന്നിട്ടുണ്ടാകാം. ഇൻഹിബിറ്ററുകളുടെ ആഘാതം കുറയ്ക്കുന്നതിന് വ്യത്യസ്ത തന്ത്രങ്ങൾ നിലവിലുണ്ട്. ഉചിതമായ പോളിമറേസിന്റെ തിരഞ്ഞെടുപ്പ് ഇൻഹിബിറ്റർ പ്രവർത്തനത്തിൽ കാര്യമായ സ്വാധീനം ചെലുത്തും. പിസിആർ ഇൻഹിബിഷൻ കുറയ്ക്കുന്നതിനുള്ള മറ്റ് തെളിയിക്കപ്പെട്ട രീതികൾ പോളിമറേസ് സാന്ദ്രത വർദ്ധിപ്പിക്കുകയോ ബിഎസ്എ പോലുള്ള അഡിറ്റീവുകൾ പ്രയോഗിക്കുകയോ ആണ്.
ആന്തരിക പ്രക്രിയ ഗുണനിലവാര നിയന്ത്രണം (IPC) ഉപയോഗിച്ച് PCR പ്രതിപ്രവർത്തനങ്ങളെ തടയുന്നത് തെളിയിക്കാൻ കഴിയും.
എക്സ്ട്രാക്ഷൻ കിറ്റിലെ എത്തനോൾ, EDTA, CETAB, LiCl, GuSCN, SDS, ഐസോപ്രൊപ്പനോൾ, ഫിനോൾ തുടങ്ങിയ എല്ലാ റിയാക്ടറുകളും മറ്റ് ലായനികളും ന്യൂക്ലിക് ആസിഡ് ഐസൊലേറ്റിൽ നിന്ന് നന്നായി കഴുകൽ ഘട്ടത്തിലൂടെ നീക്കം ചെയ്യാൻ ശ്രദ്ധിക്കണം. അവയുടെ സാന്ദ്രതയെ ആശ്രയിച്ച്, അവ PCR-നെ സജീവമാക്കുകയോ തടയുകയോ ചെയ്തേക്കാം.