പിസിആർ പ്രതിപ്രവർത്തനങ്ങളിലെ ഇടപെടൽ ഘടകങ്ങൾ

പിസിആർ പ്രതികരണ സമയത്ത്, ചില തടസ്സപ്പെടുത്തുന്ന ഘടകങ്ങൾ പലപ്പോഴും കണ്ടുമുട്ടുന്നു.
പി‌സി‌ആറിന്റെ ഉയർന്ന സംവേദനക്ഷമത കാരണം, പി‌സി‌ആർ ഫലങ്ങളെ ബാധിക്കുന്ന ഏറ്റവും പ്രധാനപ്പെട്ട ഘടകങ്ങളിലൊന്നായി മലിനീകരണം കണക്കാക്കപ്പെടുന്നു, ഇത് തെറ്റായ പോസിറ്റീവ് ഫലങ്ങൾ ഉണ്ടാക്കും.
തെറ്റായ-നെഗറ്റീവ് ഫലങ്ങളിലേക്ക് നയിക്കുന്ന വിവിധ ഉറവിടങ്ങളും ഒരുപോലെ നിർണായകമാണ്.പിസിആർ മിശ്രിതത്തിന്റെ ഒന്നോ അതിലധികമോ അവശ്യ ഭാഗങ്ങൾ അല്ലെങ്കിൽ ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ പ്രതികരണം തന്നെ തടയുകയോ ഇടപെടുകയോ ചെയ്താൽ, ഡയഗ്നോസ്റ്റിക് പരിശോധന തടസ്സപ്പെടാം.ഇത് കാര്യക്ഷമത കുറയുന്നതിനും തെറ്റായ നെഗറ്റീവ് ഫലങ്ങൾക്കും ഇടയാക്കും.
തടയുന്നതിന് പുറമേ, സാമ്പിൾ തയ്യാറാക്കുന്നതിന് മുമ്പുള്ള ഷിപ്പിംഗ് കൂടാതെ/അല്ലെങ്കിൽ സ്റ്റോറേജ് അവസ്ഥകൾ കാരണം ടാർഗെറ്റ് ന്യൂക്ലിക് ആസിഡ് സമഗ്രത നഷ്ടപ്പെടാം.പ്രത്യേകിച്ചും, ഉയർന്ന താപനിലയോ അപര്യാപ്തമായ സംഭരണമോ കോശങ്ങളുടെയും ന്യൂക്ലിക് ആസിഡുകളുടെയും നാശത്തിലേക്ക് നയിച്ചേക്കാം.കോശങ്ങളും ടിഷ്യു ഫിക്സേഷനും പാരഫിൻ ഉൾച്ചേർക്കലും ഡിഎൻഎ വിഘടനത്തിനും നിരന്തരമായ പ്രശ്നത്തിനും അറിയപ്പെടുന്ന കാരണങ്ങളാണ് (ചിത്രങ്ങൾ 1, 2 കാണുക).ഈ സന്ദർഭങ്ങളിൽ, ഒപ്റ്റിമൽ ഒറ്റപ്പെടലും ശുദ്ധീകരണവും പോലും സഹായിക്കില്ല.

ചിത്രം 1 |ഡിഎൻഎ സമഗ്രതയിൽ ഇമോബിലൈസേഷന്റെ പ്രഭാവം
അഗറോസ് ജെൽ ഇലക്ട്രോഫോറെസിസ്, ഓട്ടോപ്സിയുടെ പാരഫിൻ വിഭാഗങ്ങളിൽ നിന്ന് വേർതിരിച്ചെടുത്ത ഡിഎൻഎയുടെ ഗുണനിലവാരം ഗണ്യമായി വ്യത്യാസപ്പെട്ടിരിക്കുന്നുവെന്ന് കാണിച്ചു.ഫിക്സേഷൻ രീതിയെ ആശ്രയിച്ച് എക്സ്ട്രാക്റ്റുകളിൽ വ്യത്യസ്ത ശരാശരി ശകലങ്ങളുടെ ദൈർഘ്യമുള്ള ഡിഎൻഎ ഉണ്ടായിരുന്നു.നേറ്റീവ് ഫ്രോസൻ സാമ്പിളുകളിലും ബഫർ ചെയ്ത ന്യൂട്രൽ ഫോർമാലിനും ഉറപ്പിച്ചപ്പോൾ മാത്രമാണ് ഡിഎൻഎ സംരക്ഷിക്കപ്പെടുന്നത്.ശക്തമായ അസിഡിറ്റി ഉള്ള ബൗയിൻ ഫിക്സേറ്റീവ് അല്ലെങ്കിൽ ബഫർ ചെയ്യാത്ത, ഫോർമിക് ആസിഡ് അടങ്ങിയ ഫോർമാലിൻ ഉപയോഗിക്കുന്നത് ഡിഎൻഎയുടെ ഗണ്യമായ നഷ്ടത്തിന് കാരണമായി.ശേഷിക്കുന്ന ഭാഗം വളരെ വിഘടിച്ചിരിക്കുന്നു.
ഇടതുവശത്ത്, ശകലങ്ങളുടെ നീളം കിലോബേസ് ജോഡികളായി (kbp) പ്രകടിപ്പിക്കുന്നു.

ചിത്രം 2 |ന്യൂക്ലിക് ആസിഡ് ലക്ഷ്യങ്ങളുടെ സമഗ്രത നഷ്ടപ്പെടുന്നു
(a) രണ്ട് ഇഴകളിലും 3′-5′ വിടവ് ലക്ഷ്യം ഡിഎൻഎയിൽ തകരാർ ഉണ്ടാക്കും.ഡിഎൻഎയുടെ സമന്വയം ഇപ്പോഴും ചെറിയ ശകലത്തിൽ സംഭവിക്കും.എന്നിരുന്നാലും, DNA ശകലത്തിൽ ഒരു പ്രൈമർ അനീലിംഗ് സൈറ്റ് ഇല്ലെങ്കിൽ, ലീനിയർ ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ മാത്രമേ സംഭവിക്കൂ.ഏറ്റവും അനുകൂലമായ സാഹചര്യത്തിൽ, ശകലങ്ങൾ പരസ്പരം പുനർനിർമ്മിച്ചേക്കാം, പക്ഷേ വിളവ് ചെറുതും കണ്ടെത്തൽ നിലവാരത്തിന് താഴെയുമായിരിക്കും.
(ബി) പ്രധാനമായും ഡീപ്യുരിനേഷൻ, തൈമിഡിൻ ഡൈമർ രൂപീകരണം എന്നിവ കാരണം ബേസുകളുടെ നഷ്ടം, എച്ച്-ബോണ്ടുകളുടെ എണ്ണം കുറയുന്നതിനും ടിഎം കുറയുന്നതിനും ഇടയാക്കുന്നു.നീളമേറിയ ചൂടാകുന്ന ഘട്ടത്തിൽ, പ്രൈമറുകൾ മാട്രിക്സ് ഡിഎൻഎയിൽ നിന്ന് ഉരുകിപ്പോകും, ​​കുറഞ്ഞ കർശനമായ സാഹചര്യങ്ങളിൽ പോലും അനിയൽ ചെയ്യില്ല.
(സി) തൊട്ടടുത്തുള്ള തൈമിൻ ബേസുകൾ ഒരു ടിടി ഡൈമർ ഉണ്ടാക്കുന്നു.
മോളിക്യുലാർ ഡയഗ്നോസ്റ്റിക്സിൽ പലപ്പോഴും സംഭവിക്കുന്ന മറ്റൊരു സാധാരണ പ്രശ്നം ഫിനോൾ-ക്ലോറോഫോം എക്സ്ട്രാക്ഷനുമായി താരതമ്യപ്പെടുത്തുമ്പോൾ ടാർഗെറ്റ് ന്യൂക്ലിക് ആസിഡുകളുടെ ഒപ്റ്റിമൽ റിലീസ് ആണ്.അങ്ങേയറ്റത്തെ കേസുകളിൽ, ഇത് തെറ്റായ നിഷേധങ്ങളുമായി ബന്ധപ്പെടുത്താം.കോശ അവശിഷ്ടങ്ങൾ തിളപ്പിച്ച് ലിസിസ് അല്ലെങ്കിൽ എൻസൈമാറ്റിക് ദഹനം വഴി ധാരാളം സമയം ലാഭിക്കാൻ കഴിയും, എന്നാൽ ന്യൂക്ലിക് ആസിഡ് റിലീസ് അപര്യാപ്തമായതിനാൽ ഈ രീതി പലപ്പോഴും കുറഞ്ഞ പിസിആർ സെൻസിറ്റിവിറ്റിക്ക് കാരണമാകുന്നു.

ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ സമയത്ത് പോളിമറേസ് പ്രവർത്തനം തടയുന്നു

പൊതുവേ, ഉപോൽപ്പന്ന പിസിആർ ഫലങ്ങളിലേക്ക് നയിക്കുന്ന എല്ലാ ഘടകങ്ങളെയും വിവരിക്കുന്നതിന് ഒരു കണ്ടെയ്നർ ആശയമായി ഇൻഹിബിഷൻ ഉപയോഗിക്കുന്നു.കർശനമായ ബയോകെമിക്കൽ അർത്ഥത്തിൽ, ഇൻഹിബിഷൻ എൻസൈമിന്റെ പ്രവർത്തനത്തിൽ പരിമിതപ്പെടുത്തിയിരിക്കുന്നു, അതായത്, ഡിഎൻഎ പോളിമറേസിന്റെ സജീവ സൈറ്റുമായോ അതിന്റെ കോഫാക്ടറുമായോ (ഉദാഹരണത്തിന്, ടാക് ഡിഎൻഎ പോളിമറേസിനുള്ള Mg2+) പ്രതിപ്രവർത്തനത്തിലൂടെ സബ്‌സ്‌ട്രേറ്റ്-ഉൽപ്പന്ന പരിവർത്തനം കുറയ്ക്കുകയോ തടയുകയോ ചെയ്യുന്നു.
സാമ്പിളിലെ ഘടകങ്ങൾ അല്ലെങ്കിൽ വിവിധ ബഫറുകൾ, റിയാഗന്റുകൾ അടങ്ങിയ എക്സ്ട്രാക്‌റ്റുകൾ എന്നിവ എൻസൈമിനെ നേരിട്ട് തടയുകയോ അതിന്റെ കോഫാക്ടറുകളെ (ഉദാഹരണത്തിന് ഇഡിടിഎ) കെണിയിലാക്കുകയോ ചെയ്യും, അതുവഴി പോളിമറേസ് നിർജ്ജീവമാക്കുകയും പിസിആർ കുറയുകയോ തെറ്റായ നെഗറ്റീവ് ഫലങ്ങളിലേക്ക് നയിക്കുകയോ ചെയ്യുന്നു.
എന്നിരുന്നാലും, പ്രതിപ്രവർത്തന ഘടകങ്ങളും ടാർഗെറ്റ് അടങ്ങിയ ന്യൂക്ലിക് ആസിഡുകളും തമ്മിലുള്ള പല ഇടപെടലുകളും 'പിസിആർ ഇൻഹിബിറ്ററുകൾ' ആയി നിയോഗിക്കപ്പെട്ടിരിക്കുന്നു.ഒറ്റപ്പെടലിലൂടെ കോശത്തിന്റെ സമഗ്രത തകരാറിലാകുകയും ന്യൂക്ലിക് ആസിഡ് പുറത്തുവിടുകയും ചെയ്താൽ, സാമ്പിളും അതിന്റെ ചുറ്റുമുള്ള ലായനിയും സോളിഡ് ഫേസും തമ്മിലുള്ള പ്രതിപ്രവർത്തനം സംഭവിക്കാം.ഉദാഹരണത്തിന്, 'സ്കാവെഞ്ചർമാർക്ക്' കോവാലന്റ് ഇതര ഇടപെടലുകളിലൂടെ ഒറ്റ- അല്ലെങ്കിൽ ഇരട്ട-സ്ട്രാൻഡഡ് ഡിഎൻഎ ബന്ധിപ്പിക്കാനും പിസിആർ പ്രതികരണ പാത്രത്തിൽ എത്തിച്ചേരുന്ന ടാർഗെറ്റുകളുടെ എണ്ണം കുറയ്ക്കുന്നതിലൂടെ ഒറ്റപ്പെടലിലും ശുദ്ധീകരണത്തിലും ഇടപെടാനും കഴിയും.
പൊതുവേ, ക്ലിനിക്കൽ ഡയഗ്നോസ്റ്റിക് ടെസ്റ്റുകൾ (മൂത്രത്തിലെ യൂറിയ, ഹീമോഗ്ലോബിൻ, രക്തത്തിലെ ഹെപ്പാരിൻ), ഭക്ഷണപദാർത്ഥങ്ങൾ (ഓർഗാനിക് ഘടകങ്ങൾ, ഗ്ലൈക്കോജൻ, കൊഴുപ്പ്, Ca2+ അയോണുകൾ), പരിസ്ഥിതിയിലെ ഘടകങ്ങൾ (ഫിനോൾസ്) എന്നിവയ്ക്കായി ഉപയോഗിക്കുന്ന മിക്ക ശരീര ദ്രാവകങ്ങളിലും റിയാക്ടറുകളിലും PCR ഇൻഹിബിറ്ററുകൾ ഉണ്ട്. , ഭാരമുള്ള ലോഹങ്ങൾ)

കൂടുതൽ വ്യാപകമായ PCR ഇൻഹിബിറ്ററുകൾ ബാക്ടീരിയയിലും യൂക്കറിയോട്ടിക് കോശങ്ങളിലും, ലക്ഷ്യമല്ലാത്ത ഡിഎൻഎയിലും, ടിഷ്യു മെട്രിക്സുകളുടെ ഡിഎൻഎ-ബൈൻഡിംഗ് മാക്രോമോളിക്കുളുകളിലും, കയ്യുറകളും പ്ലാസ്റ്റിക്കുകളും പോലുള്ള ലബോറട്ടറി ഉപകരണങ്ങളിൽ കാണാം.പിസിആർ ഇൻഹിബിറ്ററുകൾ നീക്കം ചെയ്യുന്നതിനുള്ള മികച്ച രീതിയാണ് എക്സ്ട്രാക്ഷൻ സമയത്തോ ശേഷമോ ന്യൂക്ലിക് ആസിഡുകളുടെ ശുദ്ധീകരണം.
ഇന്ന്, വിവിധ ഓട്ടോമേറ്റഡ് എക്‌സ്‌ട്രാക്ഷൻ ഉപകരണങ്ങൾക്ക് നിരവധി മാനുവൽ പ്രോട്ടോക്കോളുകളെ മാറ്റിസ്ഥാപിക്കാൻ കഴിയും, എന്നാൽ 100% വീണ്ടെടുക്കൽ കൂടാതെ/അല്ലെങ്കിൽ ലക്ഷ്യങ്ങളുടെ ശുദ്ധീകരണം ഒരിക്കലും നേടിയിട്ടില്ല.ശുദ്ധീകരിച്ച ന്യൂക്ലിക് ആസിഡുകളിൽ സാധ്യതയുള്ള ഇൻഹിബിറ്ററുകൾ ഇപ്പോഴും ഉണ്ടായിരിക്കാം അല്ലെങ്കിൽ ഇതിനകം തന്നെ പ്രാബല്യത്തിൽ വന്നിരിക്കാം.ഇൻഹിബിറ്ററുകളുടെ ആഘാതം കുറയ്ക്കുന്നതിന് വ്യത്യസ്ത തന്ത്രങ്ങൾ നിലവിലുണ്ട്.ഉചിതമായ പോളിമറേസ് തിരഞ്ഞെടുക്കുന്നത് ഇൻഹിബിറ്റർ പ്രവർത്തനത്തിൽ കാര്യമായ സ്വാധീനം ചെലുത്തും.പി‌സി‌ആർ ഇൻഹിബിഷൻ കുറയ്ക്കുന്നതിനുള്ള മറ്റ് തെളിയിക്കപ്പെട്ട മാർഗ്ഗങ്ങൾ പോളിമറേസ് സാന്ദ്രത വർദ്ധിപ്പിക്കുകയോ ബിഎസ്എ പോലുള്ള അഡിറ്റീവുകൾ പ്രയോഗിക്കുകയോ ചെയ്യുന്നു.
ഇന്റേണൽ പ്രോസസ് ക്വാളിറ്റി കൺട്രോൾ (ഐപിസി) ഉപയോഗിച്ച് പിസിആർ പ്രതികരണങ്ങൾ തടയാൻ കഴിയും.
എക്‌സ്‌ട്രാക്ഷൻ കിറ്റിലെ എഥനോൾ, EDTA, CETAB, LiCl, GuSCN, SDS, isopropanol, phenol എന്നിവ പോലെയുള്ള എല്ലാ റിയാക്ടറുകളും മറ്റ് ലായനികളും ന്യൂക്ലിക് ആസിഡ് ഐസൊലേറ്റിൽ നിന്ന് നന്നായി കഴുകി നീക്കം ചെയ്യാൻ ശ്രദ്ധിക്കണം.അവരുടെ ഏകാഗ്രതയെ ആശ്രയിച്ച്, അവർ PCR സജീവമാക്കുകയോ തടയുകയോ ചെയ്യാം.